2017年10月16日 星期一

作用與副作用

藥物從來都是一把雙刃劍,有作用的藥物就一定有副作用,沒有副作用的藥物就沒有作用。但只要動動腦,轉轉彎,副作用有時候也可以變成作用。

其中一種最成功地把副作用成為作用,之後風靡全球的藥物,自然是sildenafilSildenafil是一種血管擴張藥物,它可以抑制一種名為PDE5phosphodiesterase type 5)的酶,減慢cGMP的降解。cGMP是一種令血管平滑肌舒張的物質,當它的含量增多,血管就會擴張。

Sildenafil
在剛研發時是希望用作降血壓藥及冠心病藥物,研究人員的想法是當全身的血管擴張,那麼血壓自然會下降;而當通往心臟的血管擴張,心臟的血液供應增加,就可以舒緩冠心病。但奈何事與願違,初期研究得出的結果卻不太理想,藥物似乎對降血壓及舒緩冠心病並沒有幫助,研究人員打算收回藥物。但奇怪的是,不少接受藥物測試的男士卻不肯交還藥物。研究人員大感好奇,在進一步了解後,他們發現sildenafil竟然有一個奇怪的副作用,它可以令到陰莖勃起。原來PDE5在陰莖海綿體的含量比身體其他部位高,所以sildenafil對舒張陰莖海綿體血管平滑肌特別有效,海綿體的血液流量增加而充血,陰莖便會勃起。

藥廠於是重新研究把sildenafil的副作用變成作用,用作改善勃起功能障礙的藥物,成為了今天的「偉哥」。藥物風靡全球,極其成功。

另一個例子就是醫治青光眼的PGF2α類似物(PGF2α analogue),包括latanoprosttravoprost、,bimatoprost,它可以舒張眼內的睫狀肌(ciliary muscle),令到房水(aqueous humour)可以更易排走,降低眼內壓。

但藥物推出市面後,陸續有報告顯示它可以令到病人眼睫毛變長及周圍皮膚變得深色。研究學者又再嘗試化腐朽為神奇,有學者做了更大型的研究(Coronal-Perez et al. 2010),44位睫毛班禿的病人接受了傳統類固醇治療再加上latanoprost(一種PGF2A類似物)的治療,經過兩年後,17.5%的病人睫毛完全重新生長,27.5%有一定的生長,30%有少量生長,比起只接受傳統類固醇治療的病人成果較好。為PGF2α類似物治療睫毛班禿成效提供了證據。

雖然沒有大型的研究直接證實過PGF2α類似物對白蝕(vitiligo)的療效,但也有一些成功的案例,顯示PGF2α類似物也許可以增加受影響皮膚的黑色素,改善症狀。

利用藥物的「副作用」其實也不是甚麼新奇事,在醫生日常的工作中,也時不時會利用到。

最為人所知的當然就是抗組織胺(antihistamine)類藥物。抗組織胺可以抗敏感及收鼻水,但副作用是會令人昏昏欲睡。醫生有時候處方抗組織胺類藥物就是特意令到病人昏昏欲睡,令他們可以有更好的休息。醫生有時候甚至會為失眠的病人處方抗組織胺類藥物,把它們用作溫和的「安眠藥」。

又例如胰島素(insulin),大家都知道它可以降低血糖,用作治療糖尿病。但它同時會刺激細胞的鉀離子通道,令血液中的鉀走到細胞內,引起低血鉀(hypokalaemia)。但醫生也用了這個「副作用」去治療高血鉀(hyperkalaemia)。高血鉀其中一個最重要的療法就是靜脈注射胰島素與葡萄糖的混合液,這樣胰島素可以降低血鉀,葡萄糖則可以防止胰島素引起的低血糖。

同樣道理,salbutamol是一種β2受體激活劑(β2 receptor agonist),用來治療哮喘及慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease)。它也會刺激細胞的鉀離子通道,令血液中的鉀走到細胞內,所以salbutamol也是處理嚴重高血鉀的其中一個選擇。

至於利尿藥amiloride,它會抑制遠端腎小管(distal tubule)的鈉離子通道,從而達到利尿的作用,也可以用來降血壓,但它卻會令到腎小管多吸收鉀,引起高血鉀。醫生卻會利用這特性,為使用抗真菌藥物amphotericin B的病人處方amiloride。因為amphotericin B對腎的毒性很強,會令腎小管大量排出鉀,引起低血鉀,而使用amiloride正好可以增加血鉀,扭轉這問題。

抗真菌藥amphotericin B的腎的毒性大,可以引起低血鉀,醫生有時候會為病人處方利尿藥amiloride去減少鉀質流失

在一個近期的醫學會議上,史丹福曾經聽過更創新的想法。Ibrutinib是一種抑制Bruton酪氨酸激酶(Bruton tyrosine kinase)的新藥物,用來治療17p染色體有變異的慢性淋巴性白血病(chronic lymphocytic leukaemiaCLL),或者難治或反覆的CLL、被套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)及其他的一些低等B細胞淋巴癌(low grade B cell lymphoma)。副作用是令病人的B淋巴細胞大幅減少,影響免疫力。但有醫生用它來治療異體骨髓移植後出現的移植物對抗宿主疾病(Graft verses host disease),一種由捐贈者骨髓中的免疫細胞攻打受捐者身體而引起的疾病。這個做法真是完全超出史丹福的想像,令人目不睱給。


慢性淋巴性白血病(CLL)病人的周邊血液抹片(peripheral blood smear)
新藥ibrutinib被用於治療17p染色體變異、難治或反覆的CLL

史丹福又曾經聽聞過一個前輩,用藥如神。一般醫生最害怕藥物交互作用(drug interaction),即一種藥物影響了另一種藥物的含量或者藥效。前輩卻透過藥物交互作用增加藥物在身體的含量,令窮困病人可以不需用到正常人使用的劑量就已經可以有相應的藥效,減輕病人的財政負擔,真的令人拍案叫絕。

當然,把藥物的副作用變成作用是一門很高深的學問,必須要對藥物有非常深厚的認識及經驗才可以做到。大家如非專業醫護人員,切勿嘗試。

資料來源:

1.      Osterloh IH. The discovery and development of Viagra (sildenafil citrate). Sildenafil 2004:1-13.

2.      Choi YM, Diehl J, Levins PC. Promising alternative clinical uses of prostaglandin F2α analogs: Beyond the eyelashes. Journal of the American Academy of Dermatology 2015;72(4):712-716.


3.      Coronel-Pérez I, Rodríguez-Rey E, Camacho-Martínez F. Latanoprost in the treatment of eyelash alopecia in alopecia areata universalis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 2010;24(4):481-485.

2017年10月2日 星期一

諾貝爾獎特寫:「日出而作,日入而息」的生理時鐘



本年度諾貝爾生物學及醫學獎剛剛公佈了,由Jeffrey HallMichael RosbashMichael Young三位研究生物晝夜規律的遺傳學家奪得。

日出而作,日入而息。我們的身體很聰明,在早上會夠精神起床,在晚上自然有睡意。大家搭完長途機之後,都一定試過受到時差的困擾,但過了一段時間之後,身體又會重新適應,返回「日出而作,日入而息」的正常規律。大家有沒有想過,為什麼我們的身體可以這樣聰明,就像有一個內在的時鐘呢?

這個現象雖然與我們息息相關,但人類對它的認識一直不多。直到著名的分子生物學家Seymour Benzer及他學生Ron Konopka的發現,才為科學家開了一道門。Seymour Benzer的專長是研究基因與行為的關係,他與學生發現了幾種特別的果蠅,牠們都有異於正常的晝夜規律,有一種果蠅完全沒有晝夜規律,有一種的晝夜周期規律較正常長,又有一種的晝夜周期規律較正常短。經過持續的研究,他們終於發現了這些果蠅都是因為同一條位於X染色體的基因異常而引起的。Ron Konopka把這條基因命名為period,因為它控制了生理時鐘的周期規律。之後Jeffrey HallMichael Rosbash團隊,及Michael Young分別複製了period基因。

到了1990年,Jeffrey HallMichael RosbashPaul Hardin三位學者繼續對period基因與果蠅生理時鐘進行研究,他們知道period基因負責製造一種叫PER的蛋白質。但PER是如何控制晝夜規律呢?他們發現PER蛋白的含量有一個24小時的周期性變化。當果蠅「覺得」到夜晚的時候,PERmRNA會到達高峰,然後PER蛋白在約6小時後也會到達高峰。Period基因若產生變異,就會改變PER mRNA與蛋白質的波動。根據這些發現,他們提出period基因的蛋白產物有24小時的週期循環,而且利用負回饋(negative feedback)機制去抑制mRNA的製造。

Michael YoungAmita Sehgal團隊之後又發現了另一個叫timeless的基因,它的mRNA與蛋白也有24小時的周期性變化,而且timeless基因製造的TIM蛋白可以與PER蛋白結合,一起影響晝夜生理時鐘。在夜晚開始時,PERTIM蛋白開始增多,它們結合並且累積,到了夜深它們就走進細胞核入面,抑制mRNA的製造。到了1996年,Michael YoungAmita Sehgal團隊又發現光可以分解TIM蛋白,從而減少PER蛋白。這就解釋了為什麼光可以改變我們的生理時鐘。

我們知道了甚麼機制會抑制PERTIM,卻還未知道甚麼因素可以驅使他們的製造。幸好之後cycleclock基因的發現令這些問題慢慢變得清晰。Cycle基因由Joan Rutila聯同Jeffrey HallMichael Rosbash在果蠅中發現。Joseph Takahashi在老鼠中則發現了另一個重要的clock基因。Cycleclock基因的產物可以與E-box蛋白結合,激化periodtimeless基因,刺激PERTIM蛋白的製造。這些研究雖然最初在果蠅上發現,但科學家慢慢在哺乳類動物而至人類體內都找到類似的基因。

簡化的果蠅生理時鐘機制(來源:Riken Research)
這些研究令到時間生物學(chronobiology)這門新學問大鳴大效,到了今時今日,科學家已經發現了更多的基因及其機制去控制生理時鐘。這些基礎研究已經被應用到內分泌學、癌症科學、腦神經科學中;而生理時鐘的擾亂也會增加患上心血管疾病、神經退化疾病及癌症的風險。生理時鐘這個基礎研究得到諾貝爾生理學及醫學獎,充分地顯示了它在科學界的重要性。

史丹福剛聽到有朋友說facebook有人留言指「買唔起樓的科目是垃圾科」,史丹福實在感到痛心,所以我打算借一小段去談談基礎科學的重要。記得小弟一位很尊敬的教授曾經說過:”No knowledge is useless.” 世界上並沒有無用的知識,只有認識得不夠深入,不知道怎樣去用的人。基礎科學往往需要很多年的發展才可以發展到應用的階段,但這並不等如它沒有用。相反,它是非常的重要,如果沒有基礎科學的研究,我們又怎能夠發展出今天的藥物、手機、電腦、電池及各式各樣的機器呢?大家怎能夠偽善地一邊享受著基礎科學為我們帶來的便利,一邊貶低基礎科學的價值呢?在香港,做基礎科學研究是很難的,很多科學家都是非常聰明的人,但卻得到遠低於他們應得的經濟得益。既然香港給不到他們豐厚的經濟得益,我們是不是應該至少給予他們一份應得的尊敬呢?

資料來源:

1. Rosato E. Tauber E, Kyriacou CP. Molecular genetics of the fruit-fly circadian clock. European Journal of Human Genetics. 2006;14:729-738.

2. Hardin, P. Molecular Genetic Analysis of Circadian Timekeeping in Drosophila. Advances in Genetics. 2011;74:141-173.

2017年9月30日 星期六

諾貝爾獎前奏:改變生命密碼的CRISPR-Cas9技術

DNA是生命的密碼,上次介紹過很厲害的次世代定序,幫助我們破解這個密碼。但如果我們想再進一步,想改變這個密碼,從而改變生命呢?今次史丹福想介紹一個幫助我們改變基因,從而改變生命的突破性新技術──CRISPR-Cas9技術。

CRISPR-Cas9是一個可以隨意切斷任何指定的DNA位置,從而刪除或者改變某個特定基因。其實在CRISPR/Cas9出現之前,科學家都有幾個方法可以做到這個工作,如ZFNZinc Finger Nuclease)及TALENTranscription Activator-Like Effector Nuclease),但這些蛋白質都不容易製作,科學家往往要費九牛二虎之力才能編輯一個基因,而且它出錯的機會也很高。這些困難要等到 CRISPR – Cas9技術出現才得以解決。

故事發生在1990年代初,地中海的一個美麗港口──聖波拉。博士後研究生Francisco Mojica在這個港口城市長大,所以他的研究也是跟這個海港有關的Haloferax mediterranei──一種在聖波拉沼澤中分離出來,可以在極高鹽分環境下生長的細菌。他在這種細菌的DNA中找到一個很有趣的結構。這些約30bpDNA片段前後對稱,也就是正著念和反著念都相同。它們不斷重複,而且中間隔著約36bp的間隔DNA。簡單來說,你可以想像這個結構像是一條串燒,這條串燒由很多腸仔組成,但腸仔中間是不同的其他食物,可以是菠蘿,可以是魚蛋,可以是燒賣,所以結構就是「腸仔-菠蘿-腸仔-魚蛋-腸仔-燒賣-腸仔」。「腸仔」就那個約30bp,前後對稱的DNA片段;而其他食物就是中間隔著的間隔DNA

Francisco Mojica後來發現石野良純帶領團隊已經在大腸桿菌的DNA中發現了類似的結構,但這個日本的團隊似乎未領會到它的重要性,Francisco Mojica卻堅信這個特別的DNA結構一定是非常重要的。他之後繼續他的研究,他在多種細菌中都發現了類似的結構,並把這個結構命名為常間回文重複序列叢集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats),簡稱CRISPR。但這個結構有甚麼用呢?有科學家提出過DNA修復、基因調控等假設,但都找不到證據支持。結果問題還是由Francisco Mojica自己解決,他首先提出了證據,顯示CRISPR是細菌的後天免疫系統。這真是個新奇的發現,人們從來都沒有意識過細菌是有後天免疫系統的。

之後,很多科學家都投入了CRISPR的研究,他們發現原來CRISPR中間的序列是其他病毒的基因。他們也發現了幾個與CRISPR相關的基因,叫做CASCRISPR associated proteins)。當病毒入侵細菌時,會把自己的基因注入細菌中,而細菌為了防禦,它的CAS基因會轉譯出CAS蛋白,CAS會把病毒基因消化,然後把病毒基因放在CRISPR基因中間,令病毒基因變成「串燒」的一部分。

當相同的病毒再入侵細菌時,細菌已經「記得」這個基因。間隔DNA會轉錄出CRISPR RNA,簡稱crRNA。其中一種CAS蛋白Cas9會與crRNA結合,Cas9蛋白靠crRNA認出入侵的病毒基因,把基因的雙鏈DNA分開並切斷,毀滅了這個DNA,防止了病毒感染。

CRISPR如何幫助細菌對抗病毒入侵 (來源:Science in the News (Harvard University))

你們可能會覺得,這個故事到目前為止都只是一個研究細菌基因的基礎研究,為什麼可以發展成為一套改變生命密碼的革命性技術?其實很多時候,突破性的科學應用技術都是來自基礎的科學研究,而且基礎科學家最初作研究的時候,根本就不會知道這些知識在未來會有如此意想不到的應用價值。

Francisco Mojica最初研究CRISPR,純純是出於到細菌特殊基因結構的好奇,之後的發展是他完全是他意料之外的。所以當下次有人問你基礎科學研究有甚麼用的時候,你可以用這個故事為例子,並且告訴他:No knowledge is useless。世界上並沒有無用的知識,只有認識得不夠深入,不知道怎樣去用的人。

好,讓我們繼續一起看看故事的發展。Emmanuelle Charpentier是一位法國的微生物學家,她對找出一種常見細菌Streptococcus pyogenes的調節性RNA(對調節性RNA有興趣的朋友可以參考史丹福的舊文章)很有興趣,她在CRISP基因位置附近找到了幾個有潛質的RNA,但她沒有方法再進一步去得知這些RNA的特性,直到她在一個科學會議上遇上了另一位德國微生物學家Jorg VogelJorg Vogel提議用新的次世代定序技術(對次世代定序有興趣的朋友可以參考史丹福的舊文章)去研究這個問題。他們最後發現了一個協助CRISPR系統的RNA──tracer RNATracer RNA會處理crRNA,然後與CAS9一起合作抵擋病毒的入侵。

之後Emmanuelle Charpentier2011年遇到改變她一生的拍擋──加州大學柏克萊分校(University of California, Berkeley)的RNA專家Jennifer Doudna 。她們決定一起合作去繼續鑽研CRISPR-Cas9。她們有一個新想法,就是把crRNAtracer RNA連在一起,製造一個單一的RNA,她們稱這一個單一RNAsingle-guided RNA,簡稱sgRNA。而且她們發現只要她們把想要被目標DNA序列加進這個sgRNA中,sgRNA就可以引導Cas9去切割這個目標。這個方法大幅度地簡化了CRISPR-Cas9系統,令世界各地的科學家可以輕易地切割任何目標DNA序列。

a. 細菌利用crRNAtracer RNA去引導Cas9切割拍定的DNA序列
b. Emmanuelle CharpentierJennifer DoudnacrRNAtracer RNA連在一起,製造出single-guided RNA
(來源:Sander JD, Joung JK. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology 2014:32,347-355.

DNA被切割後,就可以由兩個不同的方法去修復,第一個叫non-homologous end joiningNHEJ),這個方法會為被切割帶來一個缺失(deletion)或插入(insertion),後果就是把這個基因的功能刪去。第二個方法叫做homology directed repairNDR),這個方法甚至可以把一段新基因加進被我們切割的位置。

被切斷的DNA進行修復 (來源:Science in the News (Harvard University))

與其聽史丹福的介紹,不如讓CRISPR-Cas9技術的始創人Jennifer Doudna親自為大家講解:



2013 年美國麻省理工學院的華裔生物學家張鋒將CRISPR-Cas9系統用於哺乳動物多個基因(multiplex)的編修,並獲得成功。他是CRISPR-Cas9技術的集大成者。因為以往ZFNTALEN等基因編輯技術只可以修改一個基因,但高等生物有很多的疾病或者生物特徵都是由多個基因控制的。要一次過修改多個基因,只有CRISPR-Cas9技術能做到。

但令人意想不到的是,CRISPR-Cas9技術的成功卻挑起了科學家團隊之間的不和,最後引起了一場專利訴訟。事緣Emmanuelle CharpentierJennifer Doudna 比張鋒早了 7 個月申請 CRISPR 專利,但美國專利商標局卻把第一個 CRISPR 的專利發給張鋒,這項專利涵蓋了所有用CRISPR-Cas9技術作的真核細胞(Eukaryotic cells)基因修改。Emmanuelle CharpentierJennifer Doudna 認為雖然張鋒是第一個用CRISPR-Cas9技術去修改高等生物基因的人,但張鋒的研究卻是基於她們研究的結果,所以專利理應給她們。但張鋒卻交出了 2012 年初的實驗室筆記證明他在Jennifer Doudna的發現前已經早有利用CRISPR-Cas9技術修改高等生物基因的想法。

經過多年的訴訟,美國專利局法庭終於在今年(2017年)215日宣佈,Jennifer Doudna針對張鋒的真核細胞CRISPR-Cas9基因編輯技術的專利幹擾訴求不成立。美國專利局法庭的判決稱Jennifer Doudna團隊的專利申請只是在試管中剪切DNA片段,沒有涉及細胞、基因組及基因編輯,而且她們的研究只是對自然現象的研究,不是一個新發明,所以並不能申請專利。

但不管如何,CRISPR-Cas9技術已經為科學界帶來重大的改變。它的應用包括研究基因的功能、藥物研究、改量農作物、控制害蟲,甚至是人類的基因治療。

CRISPR-Cas9技術是諾貝爾獎的超級大熱門,它在生理學及醫學獎的熱門程度差不多就等如重力波在物理學獎的熱門程度。科學界一般相信,這項技術獲獎只是時間的問題,而獲獎最大的障礙,似乎就是科學家之間的不和。

資料來源:

1. Lander E. The Heroes of CRISPR. Cell 2016:164,18-28.

2. Sander JD, Joung JK. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology 2014:32,347-355.